蛋白设计（Protein Design）是指通过计算机模拟和实验方法来设计和创建具有特定功能的全新蛋白质。该领域结合了生物化学、计算生物学、分子生物学和生物工程等多学科的知识，旨在生成具有预期功能和稳定性的蛋白质，这些蛋白质可以在医学、工业、农业等领域中发挥重要作用。
传统的蛋白设计方法有计算机辅助设计（使用算法和模拟来预测蛋白质的三维结构和功能，常用的软件包括Rosetta、Foldit等)、定向进化(通过随机突变和筛选来选择出具有所需功能的蛋白质，这种方法模拟了自然进化过程)、定点突变(通过改变蛋白质序列中的特定位点，观察其对蛋白质结构和功能的影响)等等。
近年来，深度学习推动了蛋白质结构的预测和设计。扩散模型是一种生成式模拟方法，也适用于蛋白质设计。这类模型以前存在成功率不高的问题，产生的序列基本不能折叠成目标结构。
2023年，美国华盛顿大学的David Baker和同事的研究表明，通过细调之前的RoseTTAFold的结构预测网络并将其整合到一个降噪扩散模型中，就能生成具有实际意义的蛋白质骨架，而蛋白质骨架决定了蛋白的形状和功能。最新的RoseTTAFold Diffusion（RFdiffusion）方法能测试拥有不同结构元素的设计组合，并从头开始产生蛋白质。该模型能执行不同的任务，设计单体、寡聚体和有治疗或工业应用前景的复杂结构(如结合位点)。RFdiffusion能产生总长度达600个残基的结构，复杂性和准确度都比之前更高。进一步改进该方法或能设计出复杂程度更高的新蛋白。
David Baker研究团队使用RFdiffusion技术，设计了全新的蛋白质，能够特异性地中和蛇毒中的致命毒素(David Baker, Susana Vazquez Torres, Melisa Benard Valle et al. De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins, 17 May 2024, PREPRINT (Version 1) available at Research Square [https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4402792/v1])。
相关背景知识: 蛇毒中的三指毒素（3FTxs）是一类高度致命的神经毒素，能够引起严重的组织损伤和神经功能障碍。这类神经毒素能够迅速引发一系列病理效应，包括肌肉瘫痪、呼吸衰竭和组织坏死。这些毒素通过与受害者体内的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）结合，干扰正常的神经传导，导致生命威胁的神经毒性。
α-神经毒素是3FTX的一个重要亚类，采用多链β结构，其中三个延伸环从由高度保守的二硫键稳定的疏水性致密核心突出。短链和长链α-神经毒素的二硫键长度和数量不同。尽管序列同源性，α-神经毒素在nAChR亚型中显示出不同的药理学特征：短链和长链α-神经毒素抑制肌肉型nAChRs，但只有长链α-神经毒素与神经元α7 nAChRs39强烈结合。
使用深度学习的方法设计蛋白来中和蛇毒:
采用RFdiffusion的方法，能够创造出专门针对3FTxs的蛋白质，这些蛋白质具有高亲和力和热稳定性。下面的概念图(Figure 1d) 说明了RFdiffusion方法如何用于设计能够与3FTxs特异性结合的蛋白质。这个过程涉及多个步骤，包括生成初始的蛋白质构型，并通过迭代优化来提高其与目标毒素的结合亲和力。
Figure 1d. Schematic showing α-cobratoxin binder design using RFdiffusion. Starting from a random distribution of residues around the specified β-strands in the target toxin (dark purple), successive RFdiffusion denoising steps progressively remove the noise leading at the end of the trajectory to a folded structure interacting with α-cobratoxin β-strands.
蛋白的表征:
共有55种蛋白质设计在大肠杆菌中重组表达，SEC纯化后，通过发光细胞活力测定中18种表达为单体形式。通过SPR确定来自Naja pallida的细胞毒素的KD为271 nM，CYTX蛋白CD光谱，热稳定，Tm为61°C。
利用表达肌肉型nAChRs的人源性横纹肌肉瘤细胞系为对象，进行膜片钳研究以确定这些蛋白质的功能。对毒素 ScNt，设计的蛋白SHRT在与毒素1：1比例下，完全抑制毒素的活性；优于之前报道的针对毒素蛋白 ScNt的纳米抗体(TPL1163_02_A01）。
这个例子显示了RFdiffusion的潜力，能够显著加速蛋白质工程的研究进程，并在多领域产生深远影响。
