庚毒探源（中）
Nicholas Wade 翻译by志愿者 投稿 陌上美国
欢迎转载，请注明来自陌上美国电报频道：https://t.me/MoshangUS
前文：庚毒探源 （上）
庚毒探源，顺藤摸瓜 （中）
——是人还是自然打开了武汉的潘多拉盒子？
作者：Nicholas Wade（尼古拉斯·韦德）
（作者简介：尼古拉斯·韦德是著名的英籍作家和科技新闻记者，1942年出生于英国，1964获英国剑桥大学自然科学学士学位。他1967年到1971年间作为科学作家和编辑服务于《自然》杂志。1970年移民美国后从1972年到1982年在《科学》杂志工作了10年。他1982年始加入《纽约时报》，作为其下属的《科学时报》的专职作家和编辑工作了30年，直到2012年退休，之后还作为自由作家经常为《纽约时报》撰稿。）
武汉病毒学研究所内部
Baric博士开发过一种通用工程方法来制作对其它物种具有攻击能力的冠状病毒，他曾将这个方法传授给石博士。 他所使用的特异性靶标是培养基中和人源化小鼠（humanized mice）中的人类细胞。这些实验室小鼠是人类受试者的一种符合医学伦理的廉价替代品，它们经基因工程改造后可携带一种被称为ACE2的人类蛋白，遍布于呼吸道的细胞表面。
石博士回到武汉病毒研究所她的实验室后，重启了她用基因工程改造一种用以攻击人类细胞的冠状病毒的工作。
我们怎么能这么肯定？
我们之所以这么肯定是因为，不知出于什么奇怪的原因，她的工作是得到美国过敏和传染病研究所（NIAID）资助的，这是美国国立卫生研究院（NIH）的一个分支机构。资金资助申请书是公开资料，上面列明了她申请该资助的目的。
NIAID的研究经费下发给总承包商Daszak博士所属的生态健康联盟（EcoHealth Alliance），然后再由他们分包给石博士。下面是2018和2019财政年度资助情况的部分摘录，其中“CoV”代表冠状病毒，“S蛋白”指病毒的刺突蛋白。
CoV种间传播的测试预测。通过实验测试宿主范围的预测模型（即病毒爆发的可能性），包括反向遗传学、假病毒和受体结合试验，以及用来自不同物种和人源化小鼠的一组细胞培养基做病毒感染实验”。
- “我们将使用刺突蛋白的序列数据、感染性克隆技术、体外和体内感染实验以及受体结合分析来验证用刺突蛋白序列差异百分比阈值来预测病毒外溢可能性的假说。”
用非技术语言来说，这意味着石博士的目标就是制造出一种对人类细胞具有最高感染力的新型冠状病毒。她的计划是要找到对人体细胞具有高低不同亲和力的刺突蛋白的编码基因。然后她再把这些刺突蛋白的基因一个接一个地插入若干病毒基因组的骨架（即所谓“反向遗传学”和“传染性克隆技术”），从而制作出一组嵌合型病毒。然后她再测试这些嵌合病毒攻击人类细胞培养基（即“体外”）和人源化小鼠（即“体内”）的能力。这些信息将有助于预测冠状病毒从蝙蝠到人跃迁的所谓“外溢”的可能性。
就其研究方法而言，目的是要寻找能够感染人类的冠状病毒骨架和刺突蛋白的最佳组合。很可能该方法已经制造出了类似于SARS2的其它病毒，而且很可能找到了病毒骨架和刺突蛋白的最佳组合而制造出了SARS2本身。
尚不能确定石博士是否真的在她的实验室中制造了SARS2，因为她的研究记录已被封存。但似乎她确实在朝这个方向在走。罗格斯大学分子生物学家、和生物安全著名专家Richard H. Ebright说：“很明显，武汉病毒学研究所正在系统地制作一种新型的嵌合冠状病毒，并评估这些病毒感染人类细胞和感染能够表达人的ACE2的小鼠的能力”。
Ebright博士还说：“同样清楚的是，取决于分析时所选择的常基因组背景的不同，这项工作可能产生了SARS2本身，或SARS2的某个近祖”。这里说的 “基因组背景”指用于刺突蛋白的试验台的某个特定的病毒骨架。
现在已经很明显，SARS2来自武汉病毒研究所实验室逃逸这个说法并非仅仅是个粗略的猜测，这个说法根据的是一个详细的研发资金申请书，根据的是拿到NIAID资助的一个特定项目。
如果问即使有了上面申请资助的工作计划，但你如何知道该计划确实被执行了？对此我们可以用Daszak博士自己的话来回答。Daszak博士在过去的15个月中不断抗议说实验室逃逸论是那些反中分子发明的一种荒谬的阴谋论。
在大流行爆发之前的2019年12月9日，Daszak在接受采访时用各种溢美之词介绍了武汉病毒研究所的科研人员如何重新编程刺突蛋白并制作出能够感染人源化白鼠的嵌合型冠状病毒。
Daszak在此采访进行到约28分钟时说，“经过6到7年的努力，我们现在已经发现，存在100多种与SARS相关的新型冠状病毒，它们和SARS极为相近” 。 “其中一些在实验室中能够进入人体细胞，另外一些会在人源化的小鼠模型中引起SARS疾病，而且该疾病无法通过单克隆抗体治愈，所以也无法通过疫苗来预防。因此，这是个明确并现实的危险...”
“采访人：您说的这些不同的冠状病毒，既不能针对它们进行疫苗接种，也无法抗病毒，那么我们该怎么办呢？”
“Daszak博士：嗯，我想是这样，冠状病毒嘛，你可以在实验室中很容易地操控它们。刺突蛋白会导致很多冠状病毒引发的畜传人风险。您可以获得基因序列，也可以构建蛋白，我们与北卡大学（UNC）的Ralph Baric有很多合作。我们可以在主链中插入另一种病毒并做些实验室操作。因此，当您发现一个序列时，您将有更大的预测能力。您拥有这种多样性。现在，研发疫苗的合理做法是，当你开发一款SARS疫苗时，会用流行性的SARS（Pandemic SARS）来做，不过，让我们插入其他一些东西，这样就可以获得更好的疫苗。” 这里所谓插入的东西，可能含有一个被称为弗林蛋白酶切割位点的元素。下面我会谈到，该元素会大大增加病毒对人类细胞的感染性。
Daszak博士断断续续说出了这样一个事实，即一旦产生了某种可以攻击人类细胞的新型冠状病毒，您就可以获取该病毒的刺突蛋白并将其作为研发疫苗的基础。
我们可以想象一下几天后Daszak博士听到武汉爆发疫情时的反应。他比任何人都清楚武汉研究所的目标就是如何让蝙蝠冠状病毒对人产生传染性，也清楚该所在保护本所研发人员免遭病毒感染方面的缺陷所在。
但是，他非但没有向政府卫生当局提供自己所掌握的大量病毒研发信息，而是立即发起了一场公关运动，以图让全世界相信疫情的爆发并非来自他所研制的某个病毒。他在2020年4月的一次采访中宣称， “新冠病毒从实验室逃逸的说法纯属瞎说，这根本不是真的”。
武汉病毒学研究所的安全措施
Daszak博士也许没有意识到，抑或他太过了解，长期以来，即使是管理最好的实验室也很难避免病毒的逃逸。天花病毒在1960年代和1970年代在英国从实验室中逃逸过3次，造成80例感染和3例死亡。自那时起，几乎每年都有危险病毒从实验室泄漏的情况。近些年来，SARS1病毒成了逃逸大师，分别从新加坡和台湾的实验室中泄漏，并从位于北京的中国国家病毒学研究所泄漏了至少四次。
SARS1难以对付的原因之一是没有可用的疫苗来保护实验室的工作人员。Daszak博士在上面12月19日的采访中说，武汉病毒研究所也未能开发出疫苗来对付他们自己制造的用来感染人类细胞的冠状病毒。如果SARS2病毒是在武汉实验室中制作的，那么武汉的工作人员对该病毒是完全无法防护的，正如他们在北京的同事们对SARS1完全无法防护一样。
新型冠状病毒高危的第二个因素与实验室所需的安全等级有关。实验室的安全等级分为从BSL1到BSL4的四个等级，其中BSL4的防护最为严格，它是专为致命性病原体（例如埃博拉病毒）而设计的。
武汉病毒研究所拥有一个新的BSL4实验室，但其管理松弛状态令美国驻北京使馆去该所检查工作的国务院检查官大为震惊。“新实验室严重缺乏安全操作所需的经过适当培训的技术人员和调查人员“，该检查员在2018年1月19日的电报中如此写道。
但是，真正的问题并不是武汉BSL4实验室是否安全，而是全世界的病毒学家都不喜欢在BSL4所要求的条件下工作。您必须穿着宇航服，在密闭的橱窗中进行操作，并忍受做什么都得多花一倍时间。因此，每种病毒真正对应的安全级别总是比安全设计的标准低。
在2020年之前，包括中国在内的各国的病毒学家所遵循的规则要求在BSL3实验室条件下对SARS1和MERS病毒进行操作，但其它蝙蝠冠状病毒均可以在低一级的BSL2实验室中操作。BSL2实验室只有最起码的安全预防措施，例如戴手套、穿实验服、不在移液器中吸入液体并张贴生物危害警告标志。然而，在BSL2中做功能增强实验（GOF）所产生的某种媒介可能比SARS1或MERS的传染性还要强。如果出现这种情形，那么实验室工作人员将极有可能被感染，特别是如果没有接种疫苗。
如石博士在其出版物和其他文件中所描述的那样，她的功能获得性（GOF）冠状病毒研究工作很多是在BSL2实验室进行的。她在接受《科学》杂志采访时说：“我们对冠状病毒的研究工作是在BSL2或BSL3实验室中进行的。”
Ebright博士说，“显然，该工作的部分或全部工作是在生物安全等级2下操作的，这个标准相当于美国标准牙医诊所的生物安全等级，会对实验室工作人员在接触具有SARS2传染特性的病毒时造成不可接受的风险。
他补充说：“很显然，这项工作不应该得到资助，也不应该被执行。”
这就是他的观点，无论SARS2病毒是否真的是在该实验室中产生的。
对武汉实验室安全条件的担忧似乎并不多余。根据美国国务院于2021年4月21日的情况通报，“美国政府有理由相信，在发现首例COVID-19病例之前的2019年秋季，武汉病毒研究所的几名科研人员就已被感染，其症状与COVID-19和常见的季节性疾病一致。”
哈德森研究所（Hudson Institute）研究员、国务院前顾问David Asher在一次研讨会上提供了有关该事件的更多详细信息。他说，我们对该事件的了解一部分来自公共信息，另一部分来自情报人员收集的一些高端信息。在该研究所的BSL3实验室工作的三个人在一周之内都病倒了，均出现严重症状并需接受住院治疗。这是“我们所了解到的COVID-19的第一批已知受害者。”他说，不能完全排除流感的可能，但在当时情况下似乎不太可能。
比较SARS2起源的两个对立说法
上面提到的证据让我们更加相信SARS2病毒是在实验室中制作的并逃逸了。这说法很严重，但无论多么严重，都缺乏实锤证据。实锤证据是，SARS2或其前体的确是在武汉病毒研究所或其相关实验室开发的。由于无法获取此类记录，另一个替代方法是列出有关SARS2病毒若干重要事实，然后看两个对立起源解释（自然发生论和实验室逃逸论）哪个能做出更好的解释。下面是对两种假说的四个检验，其中的两个涉及技术细节，对那些愿意深究的人来说，这些技术细节可能最具说服力。
1）起源地
让我们从地理位置开始。SARS病毒的两个已知近属是从中国南部省份云南山洞中的蝙蝠身上收集的。如果SARS2病毒先感染了云南这些山洞附近地区的居民，那将强烈支持该病毒是自然传播给人类的说法。但实际情形不是这样，疫情首先在远离山洞1500公里外的武汉市爆发。
SARS2所属的蝙蝠病毒家族叫β-冠状病毒，它会感染遍布中国南部中菊头蝠（Rhinolophus affinis）。蝙蝠的活动范围大约是50公里，所以不可能到达武汉。无论如何，第一波Covid-19爆发的时间是2019年9月，当时湖北省的气温已经很低，足以使蝙蝠进入冬眠状态。
会不会蝙蝠病毒先感染了一些中间宿主？如果如此，需要蝙蝠种群长期与中间宿主频繁接触，而此中间宿主还须经常与人接触。假设真有此病毒交换，该交换一定是在武汉这个繁华的都市之外进行的，因为我们知道武汉市并不是菊头蝠群的自然栖息地。逻辑上说，携带这种高传染性病毒的被感染者（人或动物）一定在去武汉的途中没有传染过任何其他人，而且他或她的家人中没有人发病，如果该人是乘坐火车去的武汉，也没有其他乘客被传染。
换言之，如果该病毒是在武汉以外的地方产生的话，那么该病毒必须一路不留任何痕迹，直接在武汉爆发。
用实验室逃逸说来解释的话，武汉起源说就很好理解。武汉是中国冠状病毒研究的领先研究中心，如上所述，那里的研究人员一直试图通过基因工程将蝙蝠冠状病毒改造的能够攻击人类细胞。而且他们是在安全性最低的BSL2实验室中做的这项工作。如果在那里做出了不曾预料的高传染性的SARS2的病毒，则其逃逸就不足为奇了。
2）病毒自然史与进化
瘟疫爆发的最初地点只是病毒自然史这个大问题的一小部分。病毒并不会一次接触就从一种物种跳到另一种物种。那些适变成能够攻击蝙蝠细胞的冠状病毒刺突蛋白需要反复多次跳到另一个物种（其中大多数会失败），才能获得幸运的突变。这个突变使得RNA单元发生了某种变化，导致某个异样的氨基酸被结合进刺突蛋白中，使其具有攻击其它物种细胞的能力。
通过多次这样的变异调整后，该病毒逐渐适应了它的新宿主，例如一些蝙蝠经常接触的动物。之后，当病毒从中间宿主向人传播时，以上过程再次被重复。
对于SARS1，研究人员记录了其刺突蛋白的连续变化，即该病毒是如何逐步演变成危险的病原体的。SARS1病毒从蝙蝠传给灵猫后，其刺突蛋白经6次突变成为一种温和的病原体后才传给人类。之后又经14次突变后变的更加适应人体，再经过4次突变后开始爆发疫情。
可是当你在SARS2病毒中企图寻找类似的突变路径时，会感到出奇的诧异。至少到近期，该病毒几乎没有任何变异。该病毒从出现之始就很好地适应了人类细胞。布罗德研究所（Broad Institute）Alina Chan所领导的研究人员将SARS2与后期已经适应了人体的SARS1进行了比较，发现这两种病毒均具有类似的人体适应性。他们写道：“当2019年末首次检测到SARS2时，它已经预先适应了人类传播，其适应程度与病毒在疫情后期的人体适应性相似。”
即使是那些反对实验室起源说的人也认为SARS2基因组具有不同寻常的一致性。Baric博士写道：“在中国武汉发现的早期菌株的遗传多样性十分有限，这表明该病毒可能出自某个单一来源。”
显然，单一来源与实验室逃逸说相吻合，而与自然发生论相矛盾，因为自然演化的基本特征就是存在大量的变异和选择。
SARS2基因组结构的高度一致性说明不存在什么中间宿主，而且在自然中的确也没有发现有这种宿主。
自然发生论的支持者（嘲讽地）说，SARS2在获得其传染特性前可能是在某个人群中经历过孵化，不过这个人群还不知道在哪里。或者说该病毒直接跳到了中国之外的某个中间宿主身上。
以上这些猜想都是可能的，但是很牵强。实验室泄漏说的支持者有一个简单的解释。 之所以SARS2从一开始就适应了人类细胞，是因为该病毒就是在实验室中用人源化小鼠中或在人类细胞培养而成的，正如Daszak在资助申请书中描述的那样。它的基因序列几乎没有任何多样性，因为实验室培养物的标志就是基因序列具有高度一致性。
实验室发生说的支持者如此戏说：SARS2病毒当然在传播给人类前先感染了某个中间宿主。我们已经找到了这个中间宿主，它就是武汉病毒学研究所使用的人源化小白鼠。
3）弗林蛋白酶切割位点（Furin Cleavage Site）
那么，SARS2是如何获得其弗林蛋白酶切割位点的呢？它既可以自然地获得，也可以在功能获得实验（GOF）中将其插入S1/S2的交界处而获得。
先来考虑自然起源论。病毒演化靠两种方式，一是突变，二是重组。突变是个DNA（或冠状病毒的RNA）随机变化的过程，其结果通常是蛋白链中的某个氨基酸被另一个所置换。这些突变大多数对病毒演化是有害的，但自然选择总会保留下若干有用的突变。SARS1刺突蛋白的靶向偏好逐渐从蝙蝠细胞转换为灵猫细胞，然后再转到人类细胞，靠的就是这种突变。
突变似乎不太可能产生SARS2的弗林蛋白酶切割位点，尽管不能完全排除这个可能。该位点的四个氨基酸单元聚在一起，并且都位于S1 / S2连接处的正确位置。突变是由复制错误（当产生成新的病毒基因组时）或部分基因组发生化学变性时随机产生的。因此，它通常会影响蛋白链上不同位置上的单个氨基酸。像弗林蛋白酶切割位点那样的一串氨基酸更有可能通过另一种流程，即所谓重组（recombination），而被整体获得。
重组是当两种病毒侵入同一细胞时，两种病毒的基因组材料发生偶然的交换时发生的，其后代是用另一个病毒的RNA的基因碎片组装而成的。β-冠状病毒只会与其他β-冠状病毒结合，但可以通过重组获得共同基因池中的任何遗传要素。他们唯一无法获得的是基因池中所不存在的要素。我们知道，没有任何与SARS相关的β-冠状病毒（SARS2所属的类）具有弗林蛋白酶切割位点。
自然发生说的支持者说，SARS2的弗林蛋白酶切割位点可能是从一些未知β-冠状病毒中获得的。不过与蝙蝠SARS相关的β-冠状病毒显然不需要弗林蛋白酶切割位点来感染蝙蝠细胞，因此SARS2不大可能真正含有这样一个位点，而且事实上目前还没有发现此位点。
自然发生说的支持者的下一个论点是，SARS2是从人体中获得的弗林蛋白酶切割位点的。他们说SARS2的前体可能已经在人群中传播了数月或数年，在此过程中SARS2从人类细胞中获得了弗林蛋白酶切割位点，这时就该爆发疫情了。
果真如此的话，医院的监控系统中应有被缓慢演化的SARS病毒所感染的病人的记录。但是到目前为止，还没有发现任何记录。根据世界卫生组织关于该病毒起源的报告，湖北省（武汉市所在的省）的监控医院定期监测流感样疾病，但“并无任何证据表明在2019年12月爆发新冠之前的几个月中有大量SARS-2传播。”
因此，很难解释SARS2病毒是如何自然地通过突变或重组获得弗林蛋白酶切割位点的。
剩下只有功能获得实验（GOF）还没有讨论了。对于那些认为SARS2来自实验室逃逸的支持者而言，解释弗林蛋白酶的切割位点不是个问题。Steven Quay博士是位对SARS2起源感兴趣的生物技术创业者，他写道： “自1992年以来病毒学界就知道，制造致命病毒的一种可靠方法就是在实验室中在S1/S2交界处加入弗林蛋白酶切割位点” 。他还说， “在公开发表的文献中，包括武汉冠状病毒研究病毒所所长石正立在内，至少涉及11个功能获得实验，都是在SARS病毒中加入弗林蛋白切割位点使其具有更强的感染性。”
4）密码子问题
众所周知（或至少可以回想一下高中课本），遗传密码使用三个DNA单位（碱基）来表示蛋白链上的每个氨基酸单位。当以3个为一组进行读取时，这4个不同的DNA单位可以产生4 x 4 x 4或64种不同的三联体，或称“密码子” （codons）。由于只有20种氨基酸，因此密码子的数量远远多余氨基酸的数量，所以相同的氨基酸可能以多个密码子来表示。例如，氨基酸中的精氨酸（arginine）可以用六个不同的密码子（CGU，CGC，CGA，CGG，AGA或AGG）来表示，其中的A、U、G和C代表RNA中的四种不同单元。
这就是有趣之处。不同的生物体具有不同的密码子偏好。人体细胞喜欢用CGT、CGC或CGG来表示精氨酸，但其中的CGG则是冠状病毒最不喜欢的精氨酸表示方法。在研究SARS2基因组中的氨基酸在弗林蛋白切割位点如何被编码时，请记住这一点。
现在从功能的角度来谈谈为什么SARS2带有弗林蛋白酶切割位点而其表亲病毒则无此位点。通过计算机可将SARTS2和其近亲冠状病毒（最接近的是RaTG13）基因组的近30,000个核苷酸的序列串进行排列和比较。可见，与RaTG13相比，SARS2在S1/S2连接处插入了12个核苷酸。插入物的序列是T-CCI-CGG-CGG-GC。CCT用以编码脯氨酸（proline），两个CGG用以编码两个精氨酸（arginines），而GC则是用来编码丙氨酸（alanine）的GCA的起始密码子。
这个插入物有许多奇怪的特性，但最奇怪的是两个并排的CGG密码子。SARS2的精氨酸密码子中只有5％是CGG，而任何β-冠状病毒中都没有发现过双CGG CGG密码子排列。那么SARS2是如何获得这5%的CGG的呢？要知道，CGG被人类细胞所偏爱，但并不为冠状病毒所偏爱。
自然发生论的支持者要解释SARS2的弗林蛋白酶切割位点各种特征可不容易。他们必须假设在病毒基因组上极少发生重组的位点上的确发生了重组事件，还要解释为什么会在SARS2在S1/S2点位（这可是冠状病毒基因组中唯一能够大大加强病毒传染性的重组点位）插入12个核苷酸序列，其中还含有β-冠状病毒库根本没有的一对精氨酸CGG密码子。
进化总是会产生小概率事件，Robertson博士这句话看似正确但其实不然。病毒可以产生无数变体，但我们能看的，只是自然选择后活下来的十亿分之一。Robertson博士的观点过于夸大了自然产生小概率事件的能力。例如，功能获得实验（GOF）的任何结果都可以解释为进化可以在时间中实现的事情。数字游戏也可以用另一种方式玩。为了让弗林蛋白酶切割位点在SARS2中自然发生，必须发生连续发生一系列事件。我们上面说过，这个事件链中的每一个都是小概率事件。一条带有若干小概率事件的长链是不可能完成的。
按照实验室逃逸论，SARS2中含有一对CGG密码子就不奇怪了。这个人类偏爱的密码子在实验室中经常使用。因此，凡试图在病毒基因组中插入弗林蛋白酶切割位点者，就会在实验室中合成能制备PRRA的序列，并且很可能会使用CGG来实现。
（待续）
联系方式：
电报频道: https://t.me/MoshangUS
YouTube：https://bit.ly/3pKShXu
社区建设群：https://bit.ly/35Jtpak
教育生活群：https://bit.ly/3fs7FFR
推特：https://twitter.com/MoshangUsa
原文链接：
https://nicholaswade.medium.com/origin-of-covid-following-the-clues-6f03564c038
