文章来源: 科技在线
SARS-CoV-2的特征之一即为在S1和S2的交界处有一个四氨基酸的插入，这种被称为弗林蛋白酶剪切位点的插入是SARS-CoV-2独有的。研究团队此番在RmYN02中S1和S2交界处也发现插入了三个残基PAA， “虽然SARS-CoV-2插入的残基(以及由此产生的核苷酸)与RmYN02中的残基不同，但可以表明它们是一个独立的插入事件，它们在野生动物(蝙蝠)中出现强烈表明它们是自然起源的，可能是通过重组获得的。”
最新的一项研究显示，去年在云南勐腊县获得的蝙蝠样本中发现一种新冠状病毒，该病毒在最长编码基因区1ab与新冠病毒（SARS-CoV-2）一致性达到97.2%。同时，研究团队在这一新冠状病毒中S蛋白（刺突糖蛋白）S1和S2交界处也发现插入了三个残基PAA，他们由此认为SARS-CoV-2在S1和S2的交界处的四氨基酸插入并非“人工痕迹”，有力证明了其起源于自然。
当地时间5月10日，《细胞》（Cell）旗下子刊《现代生物学》（Current Biology）在线发表了“A novel bat coronavirus closely related to SARS-CoV-2 contains natural insertions at the S1/S2 cleavage site of the spike protein ”，来自山东第一医科大学、山东省高等学校新发传染病病因流行病学实验室、中国科学院西双版纳热带植物园、中国科学院北京生命科学研究所、中国科学院武汉病毒研究所、中国科学院微生物研究所、澳大利亚悉尼大学联合团队的研究人员给出了上述结论。
在这篇论文中，研究团队报告了一种新的蝙蝠来源冠状病毒，命名为RmYN02，是在2019年5月至10月期间从中国云南省收集的227只蝙蝠的基因组分析中鉴定出来的。
研究显示，RmYN02和新型冠状病毒SARS-CoV-2在全病毒基因组中的同源性为93.3%，在与SARS-CoV-2最接近的1ab基因中的同源性为97.2%。相比之下，RmYN02受体结合域（RBD）与SARS-CoV-2之间呈现低序列同源性（61.3%），可能不与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合。
然而，与SARS-CoV-2相似，RmYN02的特点是在S蛋白的S1和S2亚单位的剪切位点处有多个氨基酸插入。研究团队认为，这就有力证明了这种插入事件在自然界中是可以发生的。
这些数据表明，SARS-CoV-2源于蝙蝠和其他野生动物中存在的病毒之间的多重自然重组。
该论文通讯作者为山东第一医科大学基础医学院病原生物学研究所所长、山东省高等学校新发传染病病因流行病学实验室主任史卫峰，中国科学院微生物研究所病毒传播预警与致病机制研究组组长、项目研究员毕玉海，中国科学院西双版纳热带植物园综合保护中心景观生态组组长、副教授Alice Catherine Hughes。该研究此前于当地时间3月5日发表在预印本网站bioRxiv上。
新冠病毒起源尚不明确，野生动物中仍有大量冠状病毒
SARS-CoV-2在中国及其他地区造成了前所未有的肺炎流行，已引起全球范围的公共卫生关注。尽管蝙蝠被认为是SARS-CoV-2 最有可能的自然宿主，但病毒的起源仍不清楚。
系统发育分析表明，SARS-CoV-2是一种不同于SARS-CoV和MERS-CoV的新型冠状病毒。到目前为止，与SARS-CoV-2最密切相关的病毒是RaTG13，它是中科院武汉病毒所石正丽团队于2013年在云南采集的一只中华菊头蝠标本中分离发现。RaTG13病毒株和新冠病毒具有96.1%的核苷酸同源性、92.9%的S基因同源性。这些数据再次说明蝙蝠是冠状病毒的重要宿主。
然而，值得注意的是，香港大学公共卫生学院新发传染病国家重点实验室管轶教授、广西医科大学胡艳玲教授团队，以及华南农业大学、岭南现代农业科学与技术广东省实验室沈永义教授、肖立华教授团队两个研究小组此前均报告了存在于马来穿山甲的SARS-CoV-2相关冠状病毒，这些穿山甲通过非法走私进入广西和广东。
研究团队提到，尽管在全基因组水平上，这些穿山甲中检测到的冠状病毒与SARS-CoV-2的距离要远于RaTG13与SARS-CoV-2的距离，但它们在S蛋白的受体结合域(RBD)上与SARS-CoV-2非常相似。
因此，尽管目前还不清楚穿山甲是否是SARS-CoV-2传播到人过程中的中间宿主，但它们可能在冠状病毒的生态学和进化中发挥重要作用。
他们认为，这些在穿山甲中发现的病毒可以表明，在野生动物中仍有大量的冠状病毒样本，其中一些可能直接参与了SARS-CoV-2的出现。
SARS-CoV-2和几种代表性蝙蝠来源冠状病毒序列比较。
一种新的蝙蝠来源冠状病毒，命名RmYN02
论文中提到，2019年5月至10月,研究团队从云南勐腊县的227只蝙蝠中一共收集了302个样本。这些蝙蝠属于20个不同种类，大多数样本从马来菊头蝠Rhinolophus malayanus（n=48, 21.1%）、中蹄蝠Hipposideros larvatus （n=41，18.1%）和小褐菊头蝠Rhinolophus stheno（n=39,17.2%)中获得。样本来源于多种组织，包括翼膜（219）、肺（2）、肝（3）和粪便（78）。
除了3只蝙蝠外，其余所有蝙蝠均为在活着时取样并被释放。
利用新一代宏基因组测序技术，研究团队首先锁定了2个初步的一致序列。这些序列产生的样本来自于2019年5月6日至7月30日期间的11份马来菊头蝠粪便。经过一系列验证步骤，研究团队得到一个部分（23395bp）和一个完整（29671bp）的蝙蝠冠状病毒基因组序列，分别命名为BetaCoV/Rm/Yunnan/YN01/2019 （RmYN01）和BetaCoV/Rm/Yunnan/YN02/2019 （RmYN02）。
相比之下，RmYN02与SARS-CoV-2密切相关，表现出93.3%的核苷酸序列一致性，但从全长基因组层面来说，RaTG13和SARS-CoV-2的一致性更高(96.1%)。RmYN02和SARS-CoV-2在大多数基因组区域(如1ab、3a、E、6、7a、N和10)非常相似（>96%序列一致性）。特别是，RmYN02在最长编码基因区1ab (n=21285)与SARS-CoV-2一致性达到97.2%。
不过，RmYN02和SARS-CoV-2在S基因中的序列一致性（核苷酸71.8%，氨基酸72.9%）远低于RaTG13和SARS-CoV-2之间的97.4%。另外值得注意的是，RmYN02和SARS-CoV-2在RBD中的氨基酸同源性仅为62.4%。而来自广东的穿山甲冠状病毒和SARS-CoV-2在RBD中的氨基酸同源性为97.4%，也是在RBD区域目前和SARS-CoV-2最接近的。
围绕SARS-CoV-2的同源模型、体外实验和S蛋白的三维结构分析结果都表明，SARS-CoV-2和SARS-CoV一样，也可以利用ACE2作为细胞受体。研究团队也同样使用同源模型分析了RmYN02、RaTG13和两个穿山甲CoVs的RBD。
RmYN02和代表性冠状病毒RBD结构的同源建模和结构比较。
研究发现，RmYN02 RBD中的氨基酸缺失在受体结合位点附近形成了两个比SARS-CoV-2 RBD短的环。重要的是，在SARS-CoV、SARS-CoV-2、RaTG13、穿山甲/MP789/2019、穿山甲/GX/P5L/2017的外子域（external subdomain ）保守的二硫键在RmYN02中缺失了。研究团队推测，这些缺失可能导致构象变化，从而减少RmYN02 RBD与ACE2的结合，甚至导致不结合。
当然也有可能的一种情况是，包括RmYN02、ZXC21和ZC45在内的环缺失的SARS相关冠状病毒，使用了一种我们目前未知的受体。
值得一提的是，此前有研究认为，RBD中的6个氨基酸残基(L455、F486、Q493、S494、N501和Y505)是SARS-CoV-2与ACE2有效受体结合的主要决定因素。与同源建模一致，穿山甲/MP789/2019在所有6个位置上都具有与SARS-CoV-2相同的氨基酸残基。相比之下，RaTG13、RmYN02和RmYN01与SARS-CoV-2均只在1个位置上有相同的氨基酸残基。
研究团队认为，这种进化模式是重组和自然选择的复杂结合的表现。
系统发育树：A 全长基因组；B、S基因；C、RBD ；D、RdRp(RNA依赖的RNA聚合酶
研究团队还对RmYN02、RaTG13、SARS-CoV-2和穿山甲中的蝙蝠冠状病毒进行了系统发育分析。与先前的研究相符，穿山甲beta-CoVs形成两个亚型。然而，论文中提到，穿山甲是否是这些病毒的天然蓄水池，或者它们从蝙蝠或其他野生动物中独立获得，这都需要进一步验证。
更值得注意的是，在大多数病毒基因组中，RmYN02与SARS-CoV-2的亲缘关系最近，尽管这两种病毒之间仍然有一段较长的分支距离。S基因树显示，SARS-CoV-2离RaTG13较近，和RmYN02较远，这表明后者在S基因经历了重组。在RBD的系统发育树上，SARS-CoV-2和pangolin-CoV/GD最密切相关，与蝙蝠病毒都较远，再次表明重组发生。最后，完整的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因(在RNA病毒的系统发育分析中经常被使用)系统发育分析显示，RmYN02、RaTG13和SARS-CoV-2形成了一个与穿山甲病毒完全不同的亚群。
SARS-CoV-2是自然起源，可能通过重组获得
类似禽流感病毒(AIVs)血凝素(HA)蛋白的方式，冠状病毒的S蛋白在功能上分裂成两个亚基S1和S2。而在某些AIV亚型的剪切位点上插入多碱基氨基酸被认为与增强致病性有关。
值得注意的是，SARS-CoV-2的特征之一即为在S1和S2的交界处有一个四氨基酸的插入，这在其他β冠状病毒的其他谱系中没有观察到过。这种被称为弗林蛋白酶剪切位点的插入是SARS-CoV-2独有的，目前在所有检测的SARS-CoV-2序列中都发现存在。
研究团队此番在RmYN02中S1和S2交界处也发现插入了三个残基PAA，他们认为这是非常重要的。“虽然SARS-CoV-2插入的残基(以及由此产生的核苷酸)与RmYN02中的残基不同，但可以表明它们是一个独立的插入事件，它们在野生动物(蝙蝠)中出现强烈表明它们是自然起源的，可能是通过重组获得的。”
因此，这些数据有力地表明了SARS-CoV-2的自然起源。
此外，研究团队再次确定了RmYN02的蝙蝠宿主为马来菊头蝠（Rhinolophus malayanus），和一种马来菊头蝠标本中获得的序列（GenBank accession MK900703 ）100%一致。
马来菊头蝠和中华菊头蝠都广泛分布于中国西南部和东南亚地区。论文中提到，一般来说，这些蝙蝠不会长距离迁移，群居性很强，很可能生活在同一个洞穴中，这可能会促进它们之间的病毒交换和重组的发生。
值得注意的是，科学家从肛门拭子中发现了RaTG13，从粪便中发现了RmYN02。因此，粪便是蝙蝠将病毒传播给其他动物，特别是能够利用洞穴环境的物种的一种简单但可行的方法。
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石正丽团队2年前已发现蝙蝠冠状病毒感染人现象
记者盘点近年研究成果发现，蝙蝠SARSr-CoV或其他潜在病毒感染人类的首份血清学证据，两年前已得出。
2017年11月底到2018年2月，中科院武汉病毒研究所研究员石正丽团队连续发表3篇论文，表示已发现SARS相关冠状病毒在蝙蝠体内重组的证据，以及人类感染蝙蝠的SARS相关冠状病毒的现象。
石正丽团队通过对云南218位村民的血清测试，提示SARS类冠状病毒有很高的潜力直接感染人，而无需中间宿主。论文还预测，蝙蝠体内的SARS相关冠状病毒“溢出”到人类体内后，可能会引起类似SARS的疾病，建议对相关地区加强监测。
蝙蝠冠状病毒有无直接传人证据？
218云南村民血清采样，6人阳性
近日引发关注的报道中，援引了美国瓦克斯曼微生物研究所所长Richard Ebright教授的解释，称中国菊头蝠的ACE2受体与人体的ACE2受体的相似程度与其他潜在中间宿主是一样的，这表明这次感染了数万人的疫情的源头可能直接来自蝙蝠。
该报道直指中科院武汉病毒研究所研究员石正丽团队两年前做的研究。2017年11月底到2018年2月，石正丽团队连续发表3篇论文（发布平台、中英文名见文末备注），揭示了以云南采样的蝙蝠体内SARS相关冠状病毒的连贯研究成果。
论文通过相关证据，锁定了SARS病毒的源头宿主是蝙蝠。同时，发现SARS类冠状病毒有很高的潜力直接感染人，而无需中间宿主。
为进行人类感染蝙蝠SARS相关冠状病毒的血清检测，在2015年10月，石正丽团队在云南省昆明市晋宁区夕阳彝族乡4个村庄（天井，大风口，绿溪，绿溪新村）收集了218个居民的血清样本。附近有2个蝙蝠洞（燕子洞和石头洞），距离4个村庄在1.1-6.0公里之间。自2011年以来，石正丽团队一直在对这些洞穴中存在冠状病毒的蝙蝠进行纵向分子监视，并发现大量蝙蝠居住，包括被证明是SARS相关病毒主要宿主的菊头蝠（石正丽团队日前发现的与新冠病毒最接近的病毒样本，也采自菊头蝠）。
这个地区没有经历过2002-2003年SARS的暴发，他们在采样过程中也没有受试者表现出任何明显的呼吸道疾病。在这些样本中，女性有139名，男性有79名，中位年龄是48岁。有208人提供了职业数据（占95.4％）：其中85.3％为农民，8.7％为学生。大部分被调查者（81.2％）饲养或拥有牲畜或宠物，并且大多数被调查者（97.2％）曾接触或接触牲畜或野生动物。其中，有20名（9.1％）参与者目睹了蝙蝠在房屋附近飞行，其中一人处理过蝙蝠尸体。
这218个人中，有6人在SARS相关冠状病毒的检测中呈阳性，但是对他们的口腔和粪便拭子及血细胞中进行的病毒核酸检测都没有阳性。
石正丽团队在论文中表示，他们的研究提供了蝙蝠SARSr-CoV或潜在相关病毒可能感染人类的首份血清学证据。
被调查者感染来源如何锁定？
6人未接触SARS患者，1人去过深圳
论文介绍了六个阳性样本（四名男性，两名女性）的人口学统计和旅行史。
其中，大风口村有两名男性（45岁的JN162、51岁的JN129）；绿溪村两名男子（JN117，49岁，JN059，57岁）；两名女性（分别是55岁的JN053，JN041）来自天井村。在采样之前的12个月中，JN041是唯一一位有云南之外旅行史的人，她到过深圳，距离她的家乡1400公里。JN053和JN059只去过距离他们村庄1.4公里的地方。JN162前往过63公里外的云南省会昆明。JN129和JN117从未离开村庄。6人都提到，曾看到蝙蝠在他们的村庄中飞行。
这6名被调查者没有接触过SARS患者，也没有在SARS疫情暴发期间去过SARS重疫区，并且，感染SARS的康复者2-3年体内可检测抗体迅速下降，这也说明这些阳性不是由于先前感染过SARS引起的。
论文称，对于居住在蝙蝠群落附近高危人群的血清阳性率为2.7％，这表明蝙蝠体内病毒溢出是相对罕见的事件，但是这取决于抗体在人体内存在的时间，其他人的抗体可能已经减弱（以致无法检出）。
6人在受访时均表示，在调查之前的12个月中没有任何临床症状。基于细胞和人源化小鼠感染研究表明，这些病毒的毒性不如SARS病毒。石正丽团队称，考虑到这些人在村里极有可能直接接触蝙蝠的分泌物，因此他们的研究说明，一些蝙蝠体内的SARS相关冠状病毒不用经过中间宿主，就能够直接感染人类。
蝙蝠体内病毒会否频繁演变？
洞穴内存在多种蝙蝠，经常发生病毒重组
在另一篇论文中，石正丽团队称，他们研究的洞穴距离昆明市约60公里。 除了已经检测出SARS相关病毒的许多菊头蝠和蹄蝠之外，那里还存在其他蝙蝠，如鼠耳蝠。洞穴的温度约为22℃–25℃，湿度约为85％-90％。 洞穴的物理性质并不是唯一的，但是在繁殖季节，它确实容纳了特别密集的蝙蝠种群。在云南其他地区，不同物种的蝙蝠种群共同居住的类似洞穴并不罕见。
从一项为期5年的纵向研究中得出的结论最终证明，SARS病毒基因组的所有构成要素都来自云南一个地方的蝙蝠SARS相关冠状病毒。菊头蝠被认为是SARS病毒的主要天然宿主，因为在它们体内有与SARS病毒高度同源的所有SARS相关冠状病毒。细胞侵入研究表明，三种不同S蛋白序列的SARS相关冠状病毒都能够使用人的ACE2（一种细胞受体，SARS和新冠病毒目前都被证明可以结合ACE2，从而侵入细胞）作为受体。
数据表明，在同一洞穴中的SARS相关冠状病毒之间经常发生重组事件。石正丽团队证明，SARS病毒最有可能是通过菊头蝠体内的SARS相关冠状病毒重组产生。 此外，他们还发现，能够结合人类ACE2的各种SARS相关冠状病毒在这个区域的蝙蝠中交叉传染。 因此，蝙蝠体内的冠状病毒有可能“溢出”给人类，并出现类似SARS的疾病。
石正丽调查的蝙蝠洞离最近的村庄只有1.1公里，本地居民可能会接触到蝙蝠。 他们建议应继续监控该点位和其他点位的SARS相关病毒的演变，检查人类感染的风险和对村民进行血清学调查，以确定这些点位是否已经发生感染并制定干预策略，避免将来引发疾病。
蝙蝠冠状病毒传人的风险有多大？
东南亚部分地区食用蝙蝠
石正丽团队还对2009-2016年在云南和广东省采集的果蝠样品中的两种beta冠状病毒进行了纵向监测。
论文提到，蝙蝠是唯一能够飞行的哺乳动物，约占所有哺乳动物的20％。根据饮食的差异，蝙蝠分为食虫类和食果类。果蝠因为体型庞大、肉质肥厚，被非洲和东南亚一些地区的人当作美味（ideal bushmeat）。
非洲和太平洋地区的果蝠寄生多种病毒，例如马尔堡病毒、亨德拉病毒和尼帕病毒。与免疫系统相关的亨德拉病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒和狂犬病毒，已经在中国的果蝠中被检测到。此外，还从果蝠中检测到或分离出遗传物质多样的呼吸道肠道病毒、腺病毒和冠状病毒。
分别在广东省和云南省发现的两个密切相关但截然不同的beta冠状病毒（SARS和新冠病毒也属于这类病毒。——记者注）。两者都在中国的黑果蝙蝠中发现，冠状病毒可通过呼吸系统和肠道感染宿主。石正丽团队研究发现，肠道组织是两种beta冠状病毒的主要靶标。但是，在肾脏和肺部也检测到其中一种beta冠状病毒，这表明这种beta冠状病毒具有广泛的组织嗜性，并可能通过粪便和呼吸道传播，从而感染其他动物。
石正丽团队在论文中表示，中国至少有五种果蝠，全部位于热带地区。这些果蝠以水果和花朵为食，并与农民、农场频繁接触，因此增加了蝙蝠病毒向家畜和人类传播的风险。
科研人员是否存在感染风险？
采集样本易接触蝙蝠排泄物
武汉晚报2017年5月曾报道武汉市疾病预防控制中心田俊华，为科研冒着被感染风险野外捕捉蝙蝠的事迹。
报道称，采集蝙蝠样本的环境极其恶劣。蝙蝠洞内散发着恶臭，而且在悬崖峭壁上，极其危险；蝙蝠携带大量病毒，一不小心就有被感染的风险。
田俊华发现利用发出的烟火和响声惊动蝙蝠促使其活动、再拉网，捕获的蝙蝠最多。“但在操作中，田俊华忘记了做防护措施，蝙蝠尿液像雨点从头顶滴到他身上”，“蝙蝠的翅膀携带利爪，抓蝙蝠时需要用夹子，大蝙蝠被夹伤后很容易喷血；好几次蝙蝠血直接喷在了田俊华皮肤上”。
在央视“旷野青春”系列科普纪录片中，田俊华也介绍“如果我们皮肤裸露，很容易接触到蝙蝠的排泄物，污染的物体”。
田俊华知道有被感染风险，回家后会主动和妻儿保持距离，自我隔离14天。按照石正丽团队此前的研究，接触蝙蝠的分泌物，有很大几率被感染冠状病毒。
一篇发表在2013年Emerg Infect Dis（新型传染病）的论文显示，在泰国采集蝙蝠粪样本的beta冠状病毒呈阳性，建议收集蝙蝠粪的工人使用个人卫生的预防措施并改善屏障保护，以减少接触人畜共患病原体的可能性。
果子狸
论文作者之一的美国生态学家Kevin Olival曾在中国和亚洲其他地方采集过蝙蝠样本，他在接受国家地理杂志采访时称，冠状病毒不仅通过空气和呼吸道传播，也可能存在口粪传播。蝙蝠并不是很干净，如果一个水果被蝙蝠粪便污染，并掉到地上，可能就会交叉感染饲养动物（如果子狸）。
备注：
2017年11月底到2018年2月，石正丽团队在美国生物学期刊PLOS Pathogens（《病原学》）、武汉病毒研究所英文期刊Virologica Sinica （《中国病毒学》）发表3篇论文，分别是Discovery of a rich gene pool of bat SARS- related coronaviruses provides new insights into the origin of SARS coronavirus（《蝙蝠SARS相关冠状病毒丰富基因库的发现，为研究SARS病毒的起源提供了新的见解》）、Longitudinal Surveillance of Betacoronaviruses in Fruit Bats in Yunnan Province, China During 2009–2016（《2009-2016年间云南省果蝠中Beta冠状病毒的纵向监测》）、Serological Evidence of Bat SARS-Related Coronavirus Infection in Humans, China（《人类感染蝙蝠SARS相关冠状病毒的血清学证据》）。
