小颜神秘的生化实验

人生境遇不可选择,心态可以选择
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小颜2014一文提出模型的published biochemical data 被认为是指的是阎润涛的生化实验, 而不引用。  经仔细研读,我发现其实这句话也许稍有歧义, 应该读成: 

On the basis of our structure analysis and our published biochemical data, we propose a working for GLUT1 (Fig 5.)

也就是说小颜用的是自己发表的, 具体说是2012年做XylE时做的生化实验。 本文给吃瓜群众图解这些生化实验的原理,结果与意义。

一。 颜宁模型里的有关生化实验的部分。 小颜2012年一文里的生化实验不少,为简单起见, 在这里仅举一个突出的例子。小颜对模型的贡献特别突出的一点就是下面这个ICH的重要地位。  小颜用生化实验证明了这个功能团的在细胞里的糖转运里的重要作用。

二。 实验原理: 这个实验原理非常简单。 吃瓜的都该看得懂:

实验的目的是看各种原生和突变的蛋白是否还能转运葡萄糖。 见下图:蓝点是没有标记的葡萄糖,红点是用放射性标记的葡萄糖。 实验就看最后细胞里有多少放射性标记的葡萄糖。 如果正常的就是说该突变对功能影响不大,这个位点不重要; 如果少了,说明突变的位点重要。 

三。 实验数据:ICH的生化实验数据在图5C 。

四: 小颜做了两种生化实验。

吃瓜吃得仔细的群众也许能注意到上图每个数据点有两个柱子。 一个蓝色,一个绿色。

蓝色的是活蛋白实验; 绿色的是用人工合成的脂质体。 

两种实验各有各的好处: 活蛋白实验测量该蛋白在复杂生理条件下的作用,更真实,但因条件复杂,不能排除某些细胞里其他因素的影响。 而人工合成的脂质体简单, 就那一个蛋白,证明就是这个蛋白的作用,但是不能证明这是生理条件下的作用。 两者都做,起到了互补的作用,做到“严丝合缝”

小颜这个图加上2012年图2图4一共做了26个突变, 每个突变做了活细胞与脂质体两种实验,而阎润涛PNAS里做了28个突变, 其中21个用于 everted vesicles 和10个用于活蛋白的进一步的实验。 也就是说小颜2012年一文里光生化实验就跟阎润涛一文差不多, 更别说晶体实验了。

五 实验的结论:

该实验证明,ICH 有一半的突变都对转运功能非常重要,也证明了ICH 本身的重要性。 后来晶体实验suggest这个功能团起到的是门闩的作用, 对这类转运蛋白的机理探究推进了一大进步。。

六。 总结:

小颜的published biochemical data指的是她自己2012年一文里的实验。  阎润涛说小颜只有死的晶体没有活蛋白实验是不正确的。  “指而不引”也是不对的。 

 

Stegy223 发表评论于
回复 'SwiperTheFox' 的评论:

feels like you are getting there (:-)
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Stegy223' 的评论 :

总结写完了,看有没有做到 1+1=2?
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Stegy223'的评论 :
如果我理解对你和他的出发点和问题的话,很可能可以解释清楚。 不过请最好明确你们的问题, 不要让我猜谜。
Stegy223 发表评论于
你对楼下Nekono_88的“哥的不好”猜想的答复还只是1+1=3,新博文会给出一个1+1=2的“完整”解答吗?
Stegy223 发表评论于
回复 'SwiperTheFox'的评论: 坚决支持Fox先生细细考证摆事实讲道理的努力。
下一篇博文出来一定要读的。谢谢。
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Stegy223' 的评论 :

我能吊一下你的胃口吗? 正在准备的下一篇博文可以给你完整的答案。 我已经是过街老鼠, 怕没人看我的博文了, 至少拉你一个读者~~开个玩笑,哈哈。
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Nekono_88' 的评论 :
请注意,充分条件与必要条件的区别。 我说小颜引经典够了, 没说其他人必须引。 事实上,我也没抱怨老阎没引经典。
Stegy223 发表评论于
回复 'Fanreninus'的评论: “因为人家明明说模型中的第一个构象是基于2014年文中的结果,第二和三够享是2012年的结果,第四是以前的生化资料”

绝对不是和您这文坛7字头怪杰较劲的意思。你这段有点让人越看越糊涂了。

1.第一个构象是Nature2014'本文中的没错。
2. 第二个构象是基于自家Nature2012细菌的。
3. 第三个构象是基于别人家的。
4. 第四个构象还没有“The outward-open structure remains to be captured". 这里沒有生化资料的事!

经Fox先生艰苦细致的考证, “published biochemical data" 是指Nature2012'里的functional characterization 生化实验结果,与这模型中重要一点 "ICH" (Intermembrane helix domain)有关。

Nekono_88 发表评论于
回复 'SwiperTheFox' 的评论 : “哥的不好”猜想,Ins and Outs of Major Facilitator Superfamily Antiporters Christopher J. Law1, Peter C. Maloney2, and Da-Neng Wang1,他们引用Jardetzk,1966的经典文章了吗?
SwiperTheFox 发表评论于

本来不想再追究这件事了,但是阎粉们非得要我背诵不正确的阎氏语录。 那这件事就非追究到底不可了。

下面这篇综述, 老阎的老板是第二作者, 总结MFS Antiporters的机理,Antiporters就包括阎润涛所做的UhpT.

1. 总结了Alternating Access Model的机理. 没引老阎的.
2. 该文引了老阎的老板15篇文章, 没有引老阎的.

对于老阎的老板来说Yan-Maloney模型存在吗?  在相关文章里(综述)老阎老板都不引,能说是独创革新的模型吗?  为什么要其他人引?  

Ins and Outs of Major Facilitator Superfamily Antiporters
Christopher J. Law1, Peter C. Maloney2, and Da-Neng Wang1

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以下是阎粉非要我背诵错误的阎氏语录。

时不时来看看 2019-07-15 12:10:12 回复 悄悄话 SwiperTheFox:

您写下一个相关回贴或博文之前,试试记住下面这段话,能做到倒背如流则更好,中文写的。

颜宁团队与Yan/Maloney研究的葡萄糖载体蛋白是同一家族,属于MFS family,亦称 uniporter-symporter-antiporter family,都是由12个穿膜螺旋构成。参见权威综述分类 Microbiol Mol Bio Rev. 1998, 62:1-34。在这个地球上,不论载体有多少家族,揭开葡萄糖载体机理模型的只有两家,而且研究的都是在同一家族,得出的结论也是同样的。就好比哺乳动物的血液循环系统,只有一个机理模型,因为都是由一个心脏和血管构成。同理,所有的葡萄糖载体只有一个机理模型,如果哪天某人发现了另一机理模型,那他就是在我们的研究基础上的再次突破。
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Stegy223' 的评论 :

谢谢你提供的这篇论文. 这篇论文有老阎老板的参与的,中间提到这个有single binding site的alternating access mechanism, 以此为背景. 没 有 引 用 阎. 他自己老板都不认为有个阎氏模型.

This single-binding site, alternating-access mechanism, which involves a rocker-switch-type movement of the N- and C-terminal domains of the protein, is dependent upon binding-site reorientation between an inward (Ci) and outward (Co) facing conformation.
SwiperTheFox 发表评论于
更正一下我在下面对 Nekono_88 的答复里的猜测。
博文中只提了PNAS一文,所以不用更正。

我回去复习了脸红脖子粗的这个贴,细胞杂志应该做了6个突变, 这是因为老阎的蛋白(应该)一共有6个Cys.
https://bbs.wenxuecity.com/rdzn/4007220.html

我只想到了Cys与试剂的作用, 没去想要“屏蔽其他Cys“,所以要对每一个Cys做突变, 当然做推理时应该与PNAS相反。

思路是一样的,并且我理解了为什么要做这六个。 先利用Cys与试剂的作用做最简单的"proof of principle",然后再做“大面积的”工作。

说工作量小不是贬低,而是表扬。 因为要用聪明的办法以尽量少的工作量来做多的成就应该是努力方向。




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我不是特别清楚你想说什么。 只能顺着你的思路猜一猜阎做研究时的思路。

第一, 大阎不可能一个一个去做突变的穷举, 那样工作量太大。 所以要根据前人研究来抓重点, 先猜一猜哪里容易出成果,能解决什么重要问题。
 
第二, 1993年细胞的文章是个"Proof of Principle". 就是说用Cysteine (半胱氨酸)能被PCMBS抑制的特殊性质来做研究,看从技术角度成不成。 如果不成,那就没不必做把其他碱基突变成半胱氨酸这种无用功了。 这样就把范围缩小到两个Cysteines上。  做这个"Proof of Principle“的同时发现 C143面向细胞内膜,C265是“两面派”。

第三, C265是“两面派”,就说明它很可能跟转运关系重大,C265在TM7上,于是把研究范围定在 TM7的29个碱基。 一下把突破口缩小到了29/455=1/16 。   

第四,有了1993的基础,就知道这个方法可行,于是就做了TM7的29个碱基的突变。 其中21对功能有影响, 做了下一步的研究。

第五,工作量的问题本来不是特别重要。 出成果更重要。要知道, 生化实验是小颜论文工作很小一的部分,但却是大阎论文的全部。 考虑到现在突变技术更先进容易, 但是小颜做了活细胞与脂质体更全面的实验,一出一入,大概说小颜论文的很小比例的一部分与大阎整篇文章的工作量相近。  这个比较未必很准确,但大致方向是这样, 最后重申,仍然是成果更重要。

大阎如果看到我的回答, 请指正有什么错误,毕竟你是当时做实验的,我只能根据一篇论文的摘要与另一篇论文的全文猜测。 
SwiperTheFox 发表评论于
更正: 下面这个回答是给Nekono88的
Stegy223 发表评论于
随便举一列。作者真是长长一大段引出自已的模型。这样今后亲戚邻居们闹误会的可能性要小些。

“This structural information, in combination with an opus of previous biochemical, thermodynamic, and kinetic studies on both GlpT and LacY (12–17), and the closely related E. coli organic phosphate/inorganic phosphate antiporter, UhpT (18,19), have allowed us to construct a model for substrate translocation by GlpT (8,20) (parts B and C of Figure 1). ”

摘自Biochemistry 2007 46(43):12190-12197 (Peter C. Maloney one of the authors) "Kinetic Evidence Is Consistent with the Rocker-Switch
Mechanism of Membrane Transport by GlpT?"
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Stegy223' 的评论 :
请注意, 博文中比较的就是PNAS一篇文章 。 没有提细胞杂志一文。

而且如果如你所说,细胞杂志一文已经从一百多做到了四百多, 已经涵盖了PNAS 一文的内容, 为什么还要做后面这篇跟进的研究呢?
Stegy223 发表评论于
受博主这“结合率”的启发,想到了一些不同的组合:

1. Based on our structure and biochemical data ...

2. Based on our structure and (our) published biochemical data ...

3. Based on our structure and (other's) published biochemical data ...

4. Based on our structure and biochemical data as well as (other's) published biochemical data ...
Nekono_88 发表评论于
回复 'SwiperTheFox' 的评论 : 我这能看到1993文章的全文,文章中调查了更多的突变位点,从一百零几到四百多的位点。看来你大发议论是仅凭一篇摘要,这可不是窥一斑而知全豹的事。还是赶快想办法先看看全文再发议论保险一点。否则弄不好,你要给大阎一个道歉。
Stegy223 发表评论于
回复 'SwiperTheFox'的评论:是关于你说的“是断句的结合率问题:”,有点开玩笑。抱谦。本意是想说可能沒人留意到这里有个“断句的结合率问题”,二种读法,意思可真是大不相同。理想的情况是不要让读者来猜本意是那种。
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Nekono_88' 的评论 :

对第一点补充一句: 做穷举不但工作量大,而且还不知道这个方法成不成立, 有可能吃力不讨好。 所以要先做proof of principle缩小范围,争取用最小的工作量取得最大的成就。 
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Nekono_88' 的评论 : 同时回复Stegy223


我不是特别清楚你想说什么。 只能顺着你的思路猜一猜阎做研究时的思路。

第一, 大阎不可能一个一个去做突变的穷举, 那样工作量太大。 所以要根据前人研究来抓重点, 先猜一猜哪里容易出成果,能解决什么重要问题。
 
第二, 1993年细胞的文章是个"Proof of Principle". 就是说用Cysteine (半胱氨酸)能被PCMBS抑制的特殊性质来做研究,看从技术角度成不成。 如果不成,那就没不必做把其他碱基突变成半胱氨酸这种无用功了。 这样就把范围缩小到两个Cysteines上。  做这个"Proof of Principle“的同时发现 C143面向细胞内膜,C265是“两面派”。

第三, C265是“两面派”,就说明它很可能跟转运关系重大,C265在TM7上,于是把研究范围定在 TM7的29个碱基。 一下把突破口缩小到了29/455=1/16 。   

第四,有了1993的基础,就知道这个方法可行,于是就做了TM7的29个碱基的突变。 其中21对功能有影响, 做了下一步的研究。

第五,工作量的问题本来不是特别重要。 出成果更重要。要知道, 生化实验是小颜论文工作很小一的部分,但却是大阎论文的全部。 考虑到现在突变技术更先进容易, 但是小颜做了活细胞与脂质体更全面的实验,一出一入,大概说小颜论文的很小比例的一部分与大阎整篇文章的工作量相近。  这个比较未必很准确,但大致方向是这样, 最后重申,仍然是成果更重要。

大阎如果看到我的回答, 请指正有什么错误,毕竟你是当时做实验的,我只能根据一篇论文的摘要与另一篇论文的全文猜测。 
Stegy223 发表评论于
回复 'SwiperTheFox'的评论: 进入高潮之处,总不能让读者猜迷语吧(:-)
Nekono_88 发表评论于
回复 'SwiperTheFox' 的评论 : 大阎运气真好,455个氨基酸,他就调查了C143和C260-288一共30个残基,就敢出模型。还在博客里吹说“我冥思苦想出来的这个野路子其工作量巨大,我最终决定用细菌葡萄糖转运蛋白作为研究对象以解密营养分子如何进入细胞膜的世纪之谜。这个细菌葡萄糖载体基因已经被UVa大学的Kadner实验室克隆出来了(1990年发表出来了cDNA顺序)。这个膜蛋白大分子由455个氨基酸构成。我首先找到了“以假乱真”的探针分子。每个突变体在细胞膜上的两边用放射性底物单独做试验,把每一突变体的两边得到的数据分别做出图,就是用铅笔在作图纸上画出图表。这些数据都是“活体”蛋白的数据,就是说,是在细胞膜上的葡萄糖载体在转运葡萄糖分子过程中得出的数据。是葡萄糖载体在真实的运动状态下的研究结果。”,分明是在误导吃瓜群众,好像他调查了几百个残基似的。看到你的解释才明白,他的生化试验工作量只是和小颜的差不多而已。没啥了不起的。
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Stegy223' 的评论 :

就是断句的结合率问题:)

Based on (our structural analysis) and published biochemical data

还是

Based on our (structural analysis and published biochemical data)
Stegy223 发表评论于
如果是那么一目了然的话 ...
Stegy223 发表评论于
回复 'JessAB' 的评论: “不知道R. Yan和他的followers 是理解不了英语还是在有意误导一般的wxc的观众. 在Nieng的这句”On the basis of our structure analysis and published biochemical data, ...”, 已经用了”our”, 就没必要再重复”our”了.”

SwiperTheFox 先生也是在之前深入学习后又“经仔细阅读,发现"published biochemical data"是小颜自己的,所以不用引文”。如果是那么一目然,您早出来说一声就好了。

Nature2014' 是英文专业水平的文笔,加上俺认同讨论部分作者有更大自由度的原则,绝无文字上来说事之意。现在“Based on our structure and published biochemical data ” 变成/实际指 ““Based on our structure and OUR published biochemical data ”太有意思了。 Given the context of 这场争辯,把这一技术细节说清是件好事。
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Nekono_88' 的评论 :

也谢谢你问得问题,我得以改正错误:)
Nekono_88 发表评论于
回复 'SwiperTheFox' 的评论 : 谢谢耐心回复,明白了。
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Nekono_88' 的评论 :

从1993 细胞杂志的摘要看, 他没有做突变,而是利用Cysteine对试剂的敏感性做实验。 We then made a detailed study of C143 and C265, because these cysteines impart sensitivity to p-chloromercuribenzosulfonate (PCMBS),

看他1995PNAS的文章一共做了28个 (在此我要更正一下博文), 加上不用突变的C265一共研究了29个残基。

图2及表1里有21个,其中还包括1993年做的C265.

就这个问题,我和阎还有脖子粗在论坛讨论过。阎声称他做了435个? 我问他细胞杂志里有没有这个数字,他不肯告诉我。

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Nekono_88 2019-07-14 09:48:43
回复 悄悄话 大阎声称:每个突变体在细胞膜上的两边用放射性底物单独做试验,把每一突变体的两边得到的数据分别做出图,就是用铅笔在作图纸上画出图表。这些数据都是“活体”蛋白的数据,就是说,是在细胞膜上的葡萄糖载体在转运葡萄糖分子过程中得出的数据。是葡萄糖载体在真实的运动状态下的研究结果。.....,这里不知他做了多少突变体?一个?两个?大于100?大于200?大于400?到底是多少个?
Nekono_88 发表评论于
大阎声称:每个突变体在细胞膜上的两边用放射性底物单独做试验,把每一突变体的两边得到的数据分别做出图,就是用铅笔在作图纸上画出图表。这些数据都是“活体”蛋白的数据,就是说,是在细胞膜上的葡萄糖载体在转运葡萄糖分子过程中得出的数据。是葡萄糖载体在真实的运动状态下的研究结果。.....,这里不知他做了多少突变体?一个?两个?大于100?大于200?大于400?到底是多少个?
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'JessAB' 的评论 :

欢迎光临, 谢谢阅读并评论。

我同意凡人,也想让大阎清静几天。 就是见着不对的地方忍不住要把正确的内容写出来。

JessAB 发表评论于

给博主一个赞.

不知道R. Yan和他的followers 是理解不了英语还是在有意误导一般的wxc的观众. 在Nieng的这句”On the basis of our structure analysis and published biochemical data, ...”, 已经用了”our”, 就没必要再重复”our”了.

在R. Yan 的最新文章, 他居然说Nieng 的2014 Nature 文章是: “此论文的题目是:“Crystal structure of the human glucose transporter GLUT1”不仅内容一样,得出的结论一样,就是题目也一样,研究的是同一个蛋白的“同系物”.”
他说这种话很难想象他曾经是做科学的. 因为Nieng2014 的文章题目,内容不可能和任何已经发表过的文章一样, 否则就是重复不可能再被发表. 这么简单ethical的道理难道阎涧涛都不知道吗?

再且分子结构是很复杂的, 有的即使平面结构相同还可能有stereochemistry 的不同, 或还可有conformational 的不同.

阎也就忽悠一些容易或愿意被忽悠的人. 我不想浪费时间去他愽客反驳他.
SwiperTheFox 发表评论于
回复 'Fanreninus' 的评论 :

是啊,我读到的做晶体的文章好像很少没有生化实验的。
而且,不知道是否因为阎离开科研太久了, 他自己的博文和他的讨论,好像有时分不清通道与转运的概念。 他可是做这个的。。。
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