一、首先在柱子地下铺一层1cm厚的石英砂。
二、装入C18反相硅胶，甲醇润柱，活化硅胶，此步骤必不可少。
三、完全润湿硅胶后，上层留少量甲醇，轻轻敲击，使填料上层更加平整。
四、平整后，将甲醇液面压到硅胶上沿，上层加入2cm厚的沙子。
五、用过柱体系的水相置换柱子里的溶剂，准备上样。
一般情况下，湿法上样就可以了，最好用水相体系溶解样品进行上样，如果溶解度不好，可以加入少量的有机相促溶。上样后，加入展开剂梯度洗脱，加入溶剂时不要将上层的沙子冲散。注意事项：由于反相柱的压力比普通的正相柱大很多，整个操作过程要在通风橱中进行，并且加压时将通风橱拉低，安全第一。梯度洗脱过程中，可以利用正相TLC监测反应，如果爬不起来可以尝试一下EA:AcOH=200:1体系。
六、柱层析结束后，利用甲醇冲洗柱子，下次备用。
常用的水相体系：0.1%TFA水溶液，0.1%碳酸氢铵水溶液。
有机相体系：乙腈，甲醇。
