冠状病毒阅读：生物学、致病性和疫苗研发
by Bo
什么是冠状病毒？
冠状病毒(Coronavirus)是一种有包膜（或囊膜）的正链线性RNA病毒，也是一种最大的RNA病毒。冠状病毒属于网巢病毒目。我们通常说的冠状病毒是冠状病毒科的两个亚科之一。该亚科包括甲、乙、丙、丁(α，β，γ和δ )四个属。
冠状病毒的包膜是由双层脂质和跨膜蛋白组成。病毒的核衣壳由正链RNA和一种衣壳蛋白组成，其结构为螺旋对称结构。冠状病毒基因组大小为26-32KB，结构高度保守，其基本构成为：5’前导序列一复制酶一S蛋白一E蛋白一M蛋白一N蛋白一3’poly(A)。3‘端有一个帽，5’端是poly(A)尾巴，长相与真核生物的mRNA相似，可以借助被感染细胞内的蛋白质合成系统合成病毒蛋白。它的基因组大约有67%用于编码复制酶，剩下的用于编码结构蛋白和辅助蛋白。
能感染人的冠状病毒的有哪些？
冠状病毒可以感染鸟类(γ和δ 属)和哺乳动物(α和β属)，引起呼吸道和消化道疾病。目前感染人类的冠状病毒有七种：
1. HCoV-229E
2. HCoV-IC43
3. HCoV-NL63
4. HCoV-HKU1
5. SARS-CoV
6. MERS-CoV
7. SARS-CoV-2
HCoV-229E, HCoV-IC43, HCoV-NL63和HCoV-HKU1可以上呼吸道感染，是轻型自限性普通感冒的病原之一，占5-35%。但在新生儿、老年人和慢性病患者身上也可以发展成肺炎。后三种是近二十年来引起多次暴发流行新型病毒，在血清学和RNA顺序上和以前的病毒有较大区别。
近年来暴发流行的新型冠状病毒疾病有哪些？
到目前为止有三种：SARS, MERS和COVID-19。
流行于2001-2003年的严重急性呼吸系统综合征(SARS) 是由冠状病毒SARS-CoV引起，造成8098人感染，774人死亡， 病死率为9%左右。
中东呼吸综合征(MERS)流行于2012-2014年，由MERS-CoV 引起，造成855人感染，333人死亡，病死率30-40%。
冠状病毒疾病 -19(COVID-19)是指从2019年12月从武汉开始的冠状病毒流行。截止到2020年2月19日， 已经造成超过七万人感染，累计死亡人数已超过两千。COVID-19和SARS有许多相似之处，都会引起急性呼吸综合征但也有明显不同之处。
新型冠状病毒从哪里来？
一般认为，新型冠状病毒SARS-CoV, MERS-CoV 和 SARS-CoV-2的流行是由于病毒变异导致动物病毒获得感染人的能力，从而从动物跳越到人身上。这种跳越也发生在其它类型的病毒，如艾滋病病毒和埃博拉病毒。对病毒基因序列同源性的研究是追朔病毒进化过程的有效手段。武汉新冠病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV有很高的同源性，但它们属于不同的进化枝，两者分别和蝙蝠SARS样病毒基因有更高的同源性。SARS-CoV-2 和 MERS-CoV之间的同源性约为50%，和 SARS-CoV之间的同源性79%，和蝙蝠SARS样病毒之间的同源性88%。
冠状病毒是怎样感染细胞的？
冠状病毒在其双层脂质包膜外面有许多球杆状棘突，在电镜下呈皇冠状，并因此而得名。棘突和冠状病毒的感染性密切相关。棘突的顶端和细胞表面的受体结合，然后通过胞融现象将病毒的核衣壳送入细胞。棘突与细胞表面受体结合的特异性和亲和力决定了该病毒感染什动物种类和细胞类型。
冠状病毒的宿主细胞受体是什么？
大量的研究表明，冠状病毒大都利用细胞表面的蛋白酶作为其感染细胞的受体。
组成棘突的蛋白是什么？病毒表面的棘突是由S膜糖蛋白以三聚体的形式组成。S蛋白有两个区域：S1和S2。S1形成棘突的头部；S2组成棘突的柄部。受体结合区域(Receptor Binding Domain RBD)是位于S1上面的段较短的氨基酸序列，约从第455到第504个氨基酸。
SARS-Cov-2的受体找到了吗？
已经证实，SARS-CoV 和SARS-CoV-2 都是利用细胞表面的血管紧张素-I转化酶2(ACE 2)作为它们的受体。ACE2集中分部在上呼吸道、肺II型上皮细胞以及肠道上皮细胞顶端的细胞膜上，这和冠状病毒感染部位十分吻合。从SARS RBD-ACE2复合物的晶体结构可以看出，受体结合区RBD有多个基团和ACE2紧密结合。而且抗RBD特异性抗体可以有效地阻断SARS病毒的感染。最近，SARS-CoV-2 S蛋白3D结构也被UT Austin 的研究者破解，从致病机理的研究和疫苗的开发都有重要意义。
ACE2的生理功能是什么？
一般认为ACE2参与血压平衡调节，其功能和ACE1的升压功能相反。ACE2在呼吸系统的功能并不十分清楚。用内毒素诱导的小鼠实验模型证明，缓激肽的活性降解产物DABK是ACE2的底物。抑制ACE2的活性通过产生细胞因子5(CXCL-5)导致急性炎性反应。也有研究表明，ACE2可以通过调节IL-17产生降低细菌感染引起的炎症反应。因此ACE2的一个重要功能可能就是调控肺部的炎性反应。也有一些间接的证据表明，降低ACE2活性和肺纤维化有关。这些发现可以冠状病毒肺炎的病理机制和治疗提供思路。
冠状病毒和受体结合后是怎样进入细胞的？
和受体结合后，S蛋白被细胞蛋白酶TMPRSSs切割去除S1区，暴露出位于S2区的融合区，从而促使病毒包膜和细胞膜系融合，使得病毒核衣壳进入细胞浆。从核苷酸顺序上来看，新型冠状病毒在S1和S2之间的蛋白酶切割位点插入了PRRA四个氨基酸，这可能使得切割更为有效。进入细胞后，病毒利用细胞本身的蛋白质合成系统合成复制酶及其他结构蛋白和辅助蛋白。
冠状病毒是如何复制的？
病毒基因组的复制是由病毒自身编码的复制酶来完成。冠状病毒的复制酶是一个RNA依赖的RNA合成酶，而不是一个反转录酶。因此冠状病毒的复制不需要以DNA作为中间模板。
复制酶是一个庞大的多蛋白复合物，其形成涉及到转录、翻译和蛋白水平的多层面调控和加工，是一个极其复杂的过程。这涉及到16个非结构蛋白质(non-structural proteins or naps)。这些蛋白质的功能各种各样，其中包括阻断被感染细胞自身的蛋白质合成，促进细胞因子的产生，病毒蛋白的加工，RNA结合与加工、RNA解旋和复制等等。
复制酶复合物的复杂性和多活性特征给抗毒药物的设计提供了潜在的靶点，所以挑战与机遇并存。
复制酶的一个特点是RNA链的切换，导致RNA重组，从而增加病毒基因组的多样性。这是病毒进化的一个重要机制，可以导致本来不能感染人的病毒获得感染人的能力。
冠状病毒的结构蛋白有哪些？
冠状病毒的结构蛋白有四种，包括棘突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N。有些β属病毒还编码第五种蛋白(血凝素酯酶HE)。这些蛋白都是通过内质网系统合成的。N蛋白和病毒RNA结合形成核衣壳。M蛋白是病毒的结构膜蛋白，以二聚体的形式存在，通过和核衣壳结合促进病毒粒子的组装。E蛋白具有离子通道活性，参与病毒的组装和释放。E蛋白缺失可导致病毒致病性下降。
除此之外，冠状病毒还有8种辅助蛋白。辅助蛋白在不同进化枝之间差别较大。这些蛋白的功能还有待于进一步确定。
冠状病毒颗粒是在哪里组装的？
病毒颗粒的组装和释放是借助于细胞的高尔基复合物系统来完成的。
抗冠状病毒的免疫机制是什么？
和其他病毒一样，针对冠状病毒的免疫机制分为三大类：
1. 非特异性免疫：主要包括干扰素系统，NK细胞和巨噬细胞。2. 特异性体液免疫：既由B细胞和浆细胞产生中和病毒的特异性抗体3. 细胞免疫：由杀伤性T细胞、调节T细胞、记忆T细胞及其产生的白介素和细胞因子组成。
这三种免疫机制相互作用，产生有效的抑制和清除病毒感染的作用，并产生免疫记忆。由于抗病毒免疫反应需要通过攻击受感染细胞限止病毒扩散，所以也会伴随有不同程度的组织损伤。在身体遭遇毒力高的病毒感染时，免疫系统也可能发生失控，产生过激的免疫反应，造成严重的组织损伤。
冠状病毒疫苗有多重要？
疫苗是控制恶性传染病的一个重要手段。很多传染病如狂犬病、风疹、流行性腮腺炎、天花、麻疹、脊髓灰质炎、乙肝、流感等都可以通过疫苗接种得到有效控制。近年来，冠状病毒通过基因变异实现了从动物到人的跳跃，多次导致爆发流行，给人民生命财产造成巨大损失。我们已经对冠状病毒变异和致病机制研有了深刻的认识。可以预见，类似的爆发流行在未来不可避免。因此对冠状病毒疫苗和治疗药物研发的大规模投入迫在眉睫。
自从SARS暴发流行后，冠状病毒疫苗的研究引起了人们的高度重视。新型冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV有诸多相似之处，僻如两者的氨基酸顺序高度同源。从细胞受体、感染部位和病理机制上都有许多相同或相似之处。因此SARS 疫苗的研发经验对新型冠状病毒疫苗的研制有重要的指导借鉴作用。
SARS病毒疫苗的尝试有哪些类型？效果如何？
SARS病毒疫苗的形式包括重组减毒疫苗、活病毒疫苗载体、单个病毒蛋白、合成长肽和DNA疫苗等等。其中以全长S蛋白为基础的SARS疫苗最为注目，成功地诱导出中和病毒的抗体。基于S蛋白的DNA疫苗也在动物实验和初步临床经验中表现不错。这或许也是SARS-CoV-2疫苗研发应该采取一个重要途径。这种基于单个S蛋白质的疫苗的优势在于，一旦建立疫苗生产平台，就可以通过切换S蛋白的RBD区域研发未来可能出现的新的冠状病毒疫苗。
其它的策略包括设计能够被抗原呈递细胞有效加工的多肽，从而有效地诱导细胞免疫。其它的思路包括使用病毒中和抗体的被动免疫，以及利用ACE2蛋白棘突结合区为中和蛋白的人造抗体设计等。
新冠病毒SARS-CoV-2疫苖研发有哪些？
网络上流传较多的是強生公司、Inovio生物公司、Moderna 生物公司和一个澳大利亚的University of Queensland 的研究团队。Inovio从非盈利组织Coaltion for Epidermic Preparedness Innovations获得了9百万美元的资助，将釆用DNA疫苗的形式，据称将很快进入临床试验。Moderna是釆用mRNA形式，也称将很快进入一期临床。強生已经成功研制了埃博拉和Zika疫苗，准备用同样的平台开发新冠疫苗。
中国的多家实验室也在同步研发新冠疫苗。如中疾控实验室和杭州李兰娟团队等正在积极分离筛选毒株；香港袁国勇团队准备研制鼻喷式疫苗；同济大学附属医院和上海斯微生物公司合作研发mRNA疫苗等等。
冠状病毒疫苗硏发有哪些问题？
评价一个病毒的致病能力，除传染性高低、病毒的复制繁殖能力、对宿主细胞的破坏能力和体内扩散能力以外，在很大程度上也取决于机体能不能产生有效的免疫力。
冠状病毒疫苗的研究面临着许多挑战。首先，疫苗的研制到应用非常耗时。在正常情况下，疫苗的研制需要10-15年的时间。由于基因工程技术的长足发展，疫苗的设计和生产环节大大缩短。但接下来的动物实验和三级临床经验则是一个非常耗时的过程。从目前网络来源的消息来看，最快的研发计划也需几个月，长则需要数年。这显然不能解燃眉之急。
其次，冠状病毒呼吸道疾病是通过感染粘膜上皮细胞和肺泡上皮细胞所致。产生的免疫力一般不是很持久。这就需要反复多次的接种。既便如此也可能不足以完全阻止病毒感染，而只是让感染变轻一些，这可能会导致病毒持续地扩散到没有接种的易感人群中给控制流行造成巨大困难。
再者，疫苗RNA和病毒RNA之间可能会通过重组产生新的病毒，人为的造成病毒进化和感染力增加。
还有，一些研究提示，抗病毒抗体可以通过Fc受体介导进入B细胞和巨噬细胞等免疫细胞，造成免疫系统的感染。所幸的是，冠状病毒不能在B细胞和巨噬细胞中有效地复制，因此也被称为＂顿挫感染＂。但是，这种形式的感染有可能导致细胞因子的大量产生，诱导或加剧＂炎性细胞因子风暴＂的发生。
三期临床经验的最佳时机应该是在病毒流行时期。在非流时段，一般只能通检测抗病毒抗体和细胞免疫指标来间接评估疫苗的有效性。
研发冠状病毒疫苗的另外一个障碍是大的制药公司不愿意进行大量投入；由于疫苗研发周期长，即使研发成功，疫情也早已过去。从政府的资助情况来看，疫情发生时期都会给予大力支持，而疫情过后则停止资助，使得参与的科研人员没有安全感。除此之外，冠状病毒疫苗研发也存在着许多技术障碍。
显然，有效地控制和预防新型冠状病毒的爆发流行需要临床医生、医护人员、科研人员和流行病学者以及疾病控制人员日以继夜地艰苦卓绝的不懈努力。在此表示深深敬意。
后记：从武汉新冠暴发以来，和冠状病毒有关的文献可谓是铺天盖地，其中也包括很多高质量的未发或待发论文稿。许多付费杂志也纷纷免费开放相关文章。其内容包括病毒学、基因组学、疫苗研发以及流行病学统计学研究和建模等等。作者带着自己的诸多问题对相关文献进行了极为有限的选择性阅读，将阅读笔记和大家分享。如有遗漏或错误之处，请在留言中指正。同时，本人也深深意识到本文内容和表达方式的晦涩，再次感谢您花时间阅读！
作者简介： 作者毕业于华科大同济医学院八零级卫生系，后受教于同济医学院陈兆聪教授和复旦大学李育阳教授学习分子免疫和DNA重组。在美国俄亥俄州立大学获生化博士学位，多年从事基因调控和细胞信号传导研究。后来在天普大学、宾夕法尼亚大学和MD安德森癌症中心学习病理。现任新泽西Marlton医院化验室主任和Salem Medical Center病理科主任。
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