水稻 CDP-DAG 合酶的基因组编辑赋予多病原体抗性
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06205-2
干沙, 孙鹏, 孔小晶, 韩新宇, 孙启平, 自然 (2023)
基因组编辑的发现和应用为研究人员提供了精确设计作物基因组的有效工具，开创了植物育种的新纪元1。 在这里，我们展示了基因组编辑对水稻 (Oryza sativa) 工程广谱抗病性的作用。 我们首先从诱变水稻种群中分离出一个病变模拟突变体 (LMM)。 然后，我们证明了我们命名为 RESISTANCE TO BLAST1 (RBL1) 的基因中的 29 个碱基对缺失导致广谱抗病性，并表明该突变导致产量降低约 20 倍。 RBL1 编码磷脂生物合成所需的胞苷二磷酸二酰基甘油合酶 2。 RBL1 的突变导致磷脂酰肌醇及其衍生物磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PtdIns(4,5)P2) 水平降低。 在水稻中，PtdIns(4,5)P2 富含与效应子分泌和真菌感染特异性相关的细胞结构，表明它具有疾病易感因子的作用3。 通过使用靶向基因组编辑，我们获得了 RBL1 的一个等位基因，命名为 RBL1Δ12，它具有广谱抗病性，但不会降低模型水稻品种的产量，正如在小规模田间试验中评估的那样。 我们的研究证明了编辑 LMM 基因的好处，这是一种与多种 LMM 基因和作物相关的策略。
Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06205-2
Gan Sha, Peng Sun, Xiaojing Kong, Xinyu Han, Qiping Sun, Laetitia Fouillen, Juan Zhao, Yun L, Lei Yang, Yin Wang, Qiuwen Gong, Yaru Zhou, Wenqing Zhou, Rashmi Jain, Jie Gao, Renliang Huang, Xiaoyang Chen, Lu Zheng, Wanying Zhang, Ziting Qin, Qi Zhou, Qingdong Zeng, Kabin Xie, Jiandi Xu, …Guotian Li
Nature (2023)
Abstract
The discovery and application of genome editing introduced a new era of plant breeding by giving researchers efficient tools for the precise engineering of crop genomes1. Here we demonstrate the power of genome editing for engineering broad-spectrum disease resistance in rice (Oryza sativa). We first isolated a lesion mimic mutant (LMM) from a mutagenized rice population. We then demonstrated that a 29-base-pair deletion in a gene we named RESISTANCE TO BLAST1 (RBL1) caused broad-spectrum disease resistance and showed that this mutation caused an approximately 20-fold reduction in yield. RBL1 encodes a cytidine diphosphate diacylglycerol synthase that is required for phospholipid biosynthesis2. Mutation of RBL1 results in reduced levels of phosphatidylinositol and its derivative phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). In rice, PtdIns(4,5)P2 is enriched in cellular structures that are specifically associated with effector secretion and fungal infection, suggesting that it has a role as a disease-susceptibility factor3. By using targeted genome editing, we obtained an allele of RBL1, named RBL1Δ12, which confers broad-spectrum disease resistance but does not decrease yield in a model rice variety, as assessed in small-scale field trials. Our study has demonstrated the benefits of editing an LMM gene, a strategy relevant to diverse LMM genes and crops.
This is a preview of subscription content, access via your institution
Nature审稿意见22页，他们答复98页，通过！
2021年11月，李国田决定向《自然》投稿。
“这是我们第一次投稿《自然》杂志，第一稿算是‘投石问路’，能给一个修改机会就算成功！”他的博士生沙干说。
《自然》审稿人还真的给了修改机会——长达22页的建议。他们的论文原文也才5页。
一年半里，编辑每次来信的邮件末尾都附带一句话：假如有其他团队率先发表了类似的研究成果，那么论文的审稿进程就会结束。
在这种压力下，他们不断充实壮大自己的研究成果，最终拿出98页的答复。
6月14日，《自然》在线发表了华中农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室、湖北洪山实验室教授李国田团队牵头完成的研究论文。他们利用基因编辑“分子剪刀”创制了新型广谱抗病水稻材料，实现对稻瘟病、白叶枯病和稻曲病三病的抗性“加持”。
李国田（左四）团队在实验室。华中农业大学供图
真到了“无人区”，就不“卷”了
面对100多平方米空荡荡的房间，沙干欲言又止，最终蹦出一句话：“空旷的房间，6人6张电脑桌，这感觉好像传销！”
那是2018年夏天，李国田结束了5年博士后工作，带着他尚未解决的科研问题来到华中农业大学建立自己的实验室。学校提前为他招收了2名博士生、4名硕士生。师生7人都是初来乍到，必须“白手起家”、从零开始组建实验室。
躬耕狮子山下。
他们主攻的对象是李国田博士后期间的“老对手”——堪称“水稻癌症”的稻瘟病。在制种一线，不抗稻瘟病的品种会被“一票否决”。
他们的切入点是水稻-稻瘟病菌互作研究。当时，李国田已经在3000多份水稻材料中筛选出对稻瘟病菌抗性很强的类病斑突变体rbl1，并从中克隆了基因，将其命名为RBL1。
“虽然克隆了基因，但因为它的突变体能产生的种子非常少，也没有很好的技术对它进行有效改造，使得大量遗传学工作开展起来非常困难。”李国田说。
好在基因编辑技术日益成熟。用基因编辑“分子剪刀”处理类病斑突变体基因，被提上了日程。
然而在沙干眼里，稻瘟病在水稻研究中是一个妥妥的“偏科生”，并不被他这样的科研新人“宠爱”。一是因为抗稻瘟病研究者众多，二是因为“的确很难”。
不过，李国田经常在学生们疑惑时，用自己导师康振生院士30余年坚持研究一种病害的故事激励他们：“摒弃固有观念，做别人不做的工作，成为‘第一个吃螃蟹的人’。”
沙干清楚地记得，因为观察实验，他们连续3年在导师家过年。每逢这样的“闲暇”时光，李国田就会跟同学们漫谈他的科研“世界观”和“方法论”：
“科研需要逆商，别人做我一定不做。”
“什么时候都需要创新，一切新技术新手段都可实行‘拿来主义’。”
“不躺平、不摆烂，一往无前！”
“真到了‘无人区’，就不‘卷’了。”……话虽质朴，却也走心。
就这样，用基因编辑这把“剪刀”对RBL1进行精雕细琢的工作开始了。
为省时间同时编辑多个位点
“没有人把类病斑基因用在育种研究上，它属于育种家眼中不好用的那类基因。”李国田说，因为这类基因会让水稻叶子表面出现类病斑，严重时只剩下一片绿叶；分蘖数也相应减少，只留下一枝穗子。
携带类病斑突变体基因的水稻不会得稻瘟病，但也没什么籽粒产量，简直和“绝收”差不多。
“没有产量的基因谁会拿来育种？”李国田没有想到的是，他长达10年的工作最终却把类病斑突变体基因用在了水稻育种上。
李国田最初的设想是用基因编辑技术处理RBL1基因使它改变，重现不能抗稻瘟病的表型，以此证明RBL1基因的作用机理。
起初，沙干老老实实地对RBL1基因上29个碱基对进行编辑，一次编辑一个位点，希望找到能重现表型的突变体。
然而，事与愿违。“这样得到的突变体没有发生太大的变化，依然不好用。”李国田说，水稻的生长周期长，在一次编辑一个位点的策略上，他们“逗留”了至少一年多。
“时间不等人啊！当时我不知道有没有同行在研究这个基因，为了节省时间，我们决定同时编辑多个位点。”李国田说。
谁也没有料到，这个为节省时间而想出来的多位点同时编辑策略，居然成为此次发表论文的重要创新点，也是《自然》编辑部最看重的一点。
一株“特立独行”的水稻
2020年9月的一天，沙干发现实验室里一株命名为RBL12的水稻只在成熟期表现出类病斑，且仅在叶片上出现微弱的表型，并不像往常那样严重。
最让他意外的是，这株水稻“特立独行”地结出了很多种子，甚至比对照组的水稻产量还高，对稻瘟病菌的抗性也很强。
得知此事的李国田第一个反应是：不会是搞错了吧？！
因为rbl1突变体从来不会结出这么多种子，这个意外的试验结果让他们很激动。
为排除试验步骤出错，他们很快进行了5次重复试验，结果都是抗性强、产量高。
“实验室结果和大田试验往往大相径庭。”李国田深知下结论还太早。既然获得了不少种子，他决定带着团队成员到农田里去做中试试验。
从华中农大狮子山下的校园试验田，到江西、湖北的合作基地，甚至海南南繁基地，他们在5处试验田里播下了RBL12的种子。
李国田说，湖北恩施实验基地是稻瘟病的“病窝子”，在那里，对照组几乎颗粒无收，RBL12的试验田却欣欣向荣——产量、抗性都重复了实验室里的结果。
“经过大田的检验，我们终于有了把握，这个突变材料是没有问题的。”李国田随后又带领团队做进一步研究，发现RBL12不仅抗稻瘟病，还对白叶枯病和稻曲病具有广谱抗性。
“不好用”的类病斑突变体基因突然变成了育种材料中的“香饽饽”。
5页论文、22页修改建议、98页答复
“我们考虑了好几个期刊。”李国田说，但思前想后，他还是觉得要冲一冲《自然》。
论文投出去了。沙干说，那段时间是忐忑的，每天起床第一件事便是打开邮箱，看是否收到了回复。
后来，他们真的等到了22页的修改建议。“论文才有5页。”李国田说，4名审稿人非常负责任，顶级期刊对论文的“精雕细琢”让他很“震惊”。
“他们不限于逐字逐句地审核论文。其中一名审稿人一看就是内行，他把我们的基因拿去做了深入分析，指出了一些他认为有错误的地方，并提出了修改意见。这真的让我很佩服。”李国田认为，有两个建议使他们的工作“锦上添花”。
首先，RBL1基因编码水稻胞苷二磷酸-二酰甘油（CDP-DAG）合成酶，是一个重要的磷脂代谢调节枢纽。然而，这个酶的部分产物在水稻中几乎是痕量的，很难测出来。“我们写论文时考虑到测它的含量，但由于时间紧张，没有做，没想到论文审稿人提出了这个问题。”
其次，审稿人建议他们做互补试验，也就是把野生型基因重新导入编辑株系中，观察表型是否会变回野生型。“这一点是我们没有想到的，确实受益匪浅，对我们以后做机理研究非常有启发。”李国田告诉《中国科学报》。
李国田没有感到气馁，反而想：“只要你们编辑部不放弃，我们就不放弃。”他继续保持着长达十几年的习惯——每天夜跑30到40分钟。“放松，放飞想象力！好多想法都是跑步时的灵光乍现。”
李国田在实验室。
就这样，从2021年11月到2023年6月，他们经历了漫长的审稿“长跑”。最终用98页纸耐心仔细回答了22页所有问题。
抢发？还好有惊无险
“老天，真的很吃力！”补充实验持续了一年多时间，难度也超乎想象。
他们寻找新的合作伙伴，终于在法国科学院团队的支持下，搞定了磷脂含量的测定。互补试验也圆满完成了。
两次大修，三次小修。每一次修改意见返回的时候，邮件末尾都附带一句话：假如有其他团队率先发表了近似的研究成果，那么论文的审稿进程就会结束。
每当看到这句话，李国田心里就犯嘀咕：什么情况！难道编辑部知道有相似论文要发表吗？
他们投稿途中还发现，中国工程院院士万建民团队在Cell Research上发表了一个新基因CDS1，这和当时李国田正在修改进程中的论文用的基因名称一模一样！而且这个CDS1基因也是在水稻里发现的，也是类病斑基因，也抗稻瘟病，表型太像了！
“我的天，会不会是一样的！”李国田说，在他们的论文里，原来用CDS这个缩写给新基因命名，是和磷脂代谢过程有关。
好在后来经过认真核对，他们发现“万老师论文中用的CDS是指代另外一个基因，仅仅只是缩写相同，和磷脂代谢过程没有关系。还算有惊无险，当时真的把我们吓了一跳”。
经此一役，他们把基因名称由CDS1改成了RBL1，以免引起不必要的误会。
各大期刊纷纷点评
“这项研究展示了新的基因编辑技术在作物遗传改良中获得理想农艺性状的巨大潜力。”法国巴黎高等师范学院教授Yvon Jallais在《自然》上评论说。
李国田告诉《中国科学报》，他们的工作为如何使用“不好用”的基因提供了很好的示范——通过基因编辑“雕刻刀”精准改造，从而发掘出基因突变体的新性状，并用在作物育种上。
类病斑突变体基因高度保守，在小麦、玉米、番茄和生菜等作物中都有等位基因存在。初步试验显示，RBL1基因编辑在上述多种作物育种中广泛适用，可以增强作物的抗病性状。
“在这一点上，我们和《自然》编辑达成了共识。所以，编辑部邀请我们写了一篇以《利用基因组编辑技术驯化水稻基因》为题的科普短文，阐述如何利用新的基因编辑技术处理‘不好用’的基因，并在同期发表。”李国田说。
论文一发表，立刻引起了国内外学术界的关注。国际期刊《植物科学进展》《自然-植物》《分子植物》等分别邀请国内外科学家对这一成果进行评论。
中国工程院院士、宁波大学教授陈剑平认为，这项工作打破了目前水稻主要利用抗病基因育种的传统思路，展现了基因编辑赋能农业生产的应用价值，发掘的广谱抗病基因为生物育种提供了新资源，为作物病害绿色防控和国家粮食安全提供了新保障。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41586-023-06205-2
《中国科学报》 (2023-06-16 第1版 要闻)
